Journal of Visualized Experiments (JOVE，视频实验期刊在生命医学科学领域出版了许多实验视频，为可视化学习提供了平台。2018年6月5日，亚利桑那大学的研究人员在JOVE发表了一篇关于ImageJ分析小胶质细胞形态学的文章，文章题为“Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ”。
文章链接如下:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6103256/。
点击Download免费下载此链接下的操作视频(63M，MP4格式)：
3d analyze
小胶质细胞（Microglia）它是中枢神经系统中固有的免疫细胞，在大脑中起着非常重要的作用。首先，小胶质细胞对神经系统的正常发育是必要的。在大脑发育的早期阶段，约20%～80%的长投射轴突神经元凋亡并迅速清除。激素、神经递质或分泌的蛋白质等细胞外信号可与神经元上的特异性受体结合，促进神经元的存活或启动神经元的程序性细胞死亡，从而调节中枢神经系统中神经元的数量。
小胶质细胞的形态具有很高的可塑性，与其生物功能状态密切相关。正常情况下，小胶质细胞呈高分枝状，分枝结构为三级和四级，细胞间分枝很少重叠。分枝小胶质细胞通常被称为“静息小胶质细胞”。 当炎症、感染、创伤或其他神经系统疾病发生在大脑中时，小胶质细胞迅速被激活并获得吞噬功能。最初，小胶质细胞激活的定义主要是基于其形态变化。
激活的小胶质细胞体增大，突起变短，细胞形状呈圆形或杆状；激活的小胶质细胞被进一步激活和调节，细胞突起消失，细胞形状呈阿米巴状，具有吞噬功能。小胶质细胞的形态变化反映了小胶质细胞的活化状态，而小胶质细胞的活化状态与脑损伤部位的严重程度密切相关。小胶质细胞可作为大脑中不同细胞功能和功能障碍的评价指标，对小胶质细胞形态学的定量尤为重要。
ImageJ是美国NIH开发的一款功能强大的免费软件，广发应用于医学图像分析。Fiji（Fiji is just ImageJ）ImageJ预装了许多生物学插件。
https://imagej.net/Fiji/Downloads 。
用户可根据计算机系统自行下载：
今天我想和大家分享一下如何用ImageJ来分析小胶质细胞的形态学。
上图为Iba1组织化学染色的小胶质细胞，Iba1是小胶质细胞的Maker。我们使用Iba1染色来显示小胶质细胞的形状。这里推荐一个易于使用的抗体查询网站：https://www.citeab.com/ 。
该网站包含来自183家供应商的403085个抗体，总引用次数高达1470697次。我们输入IBA1：
可以看出，abacam的商品号是ab5076抗体，在Iba1文献中引用次数最多。一般来说，引用次数越高，抗体质量越好。我们还可以根据以下条件筛选需要找到的抗体：
言归正传，然后分享如何用ImageJ分析小胶质细胞的形态学。
整个分析过程流程图如下：
详细步骤如下：
1、从
https://imagej.net/Fiji/Downloads下载Fiji，下载Analyzeskeleton(2D/3D)插件：
http://imagej.net/AnalyzeSkeleton 。将下载插件放置在Plugins文件夹下重启软件。
注：将显微照片转换为二元骨架图像的整个过程只需不到1分钟。
2、如果使用荧光显微照片，请确保图像为8-bit，并将其转换为灰度，以最好地显示所有阳性染色。依次点击：Image | Lookup Tables | Grays。使用DAB明场照片，使用FFT bandpass filter 依次点击plugin滤波器：Process | FFT | bandpass filter，然后转换成灰色图片。
3、如果图像太暗，小胶质细胞的所有突起都无法显示，请调整亮度和对比度。依次点击:Image | Adjust | Brightness/Contrast。最小或最大滑块应根据需要进行调整，直到显示效果达到预期。
4、操作Unsharp Mask filter依次点击以增加对比度：Process | Filters | Unsharp Mask。此操作ImageJ设置为ImageJ(a pixel radius of 3 and mask weight of 0.6)。
5、去除斑点（Despeckle）步骤消除钝化面罩产生的胡椒盐噪声。依次点击:Process | Noise |Despeckle。
6、将图片转换为二进制图像，依次点击：Image | Adjust | Threshold。点击Apply选择阈值后。
7、单像素背景噪声可能存在于生成的二进制图像中，因此应用despeckle， close, remove outliers 处理function。
despeckle 依次点击function：Process | Noise | Despeckle；
close 依次点击function：Process | Binary | Close；
remove outliers 依次点击function：Process | Noise | Remove Outliers。
8、通过Processss，将获得图像保存进行后续分析 |Binary | Skeletonize骨骼化图像。下图显示了小胶质细胞骨骼化后的突起：
9、选择骨架图像，然后单击插件Analyzeskeleton(2D / 对骨架进行分析，并对分支信息进行检查。依次点击：Plugins | Skeleton | Analyze
Skeleton。可以得到很多结果：
例如，分支点的数量：
分支终端的数量：
突起的平均长度
最长的凸起长度
每个分支的长度
以及总长度等。
我们可以对细胞的Endpoints/cell和Process进行处理 length/cell统计：
该方法稳定性好，不同的用户(User1和User2)可以得到类似的结果:
以上ImageJ分析小胶质形态的优点是适用性普遍，分析速度快，易学。骨架分析为多个细胞提供了分析。Analyzeskeleton用于快速评估细胞分枝，并适用于整个图像。多细胞分析方法的优点是关注整个区域而不是单个细胞。因此，该方法可以快速评估图像中所有小胶质细胞的平均分枝（在终点和工艺长度方面）。希望对大家有所帮助，祝大家早日发文章！
参考文献：
Young, K., Morrison, H. Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ. J. Vis. Exp. (136), e57648, doi:10.3791/57648 (2018).
投稿邮箱：tougao@helixlife.com.cn
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